学术投稿

人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

别俊;孙茂盛;孙强明;郑建平;孙雯佳

关键词:sunvivin, 克隆, 基因表达, 纯化
摘要:目的在原核中高效表达及活性鉴定重组人survivin蛋白分子.方法应用RT-PCR的方法得到survivin的cDNA,并构建成pBV220-survivin原核表达质粒,将其导入E.coli B121(Gold)中,诱导表达survivin蛋白.通过DEAE SepharoseFastFlow离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛二步柱纯化以获取目的蛋白.用Western blotting检测表达产物.结果PT-PCR产物经测序分析与预期结果完全一致,表达质粒在E.coli B121(Go1d)中得到高效表达,表达的survivin蛋白占总蛋白含量的30%以上,表达产物以包涵体的形式存在.通过离子交换柱和分子筛二步柱纯化及复性后获得的目的蛋白,其纯度达到95%以上.Western blotting证明表达产物具有特异性.结论获得了较高纯度的survivin蛋白,为进一步深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具.
南方医科大学学报杂志相关文献
  • 洛拉曲克对胸苷酸合成酶蛋白质表达水平的动态影响

    目的研究洛拉曲克作用后不同细胞胸苷酸合成酶(TS)蛋白质表达水平的动态变化有无差异.方法时间曲线中,LoVo、Lo2细胞分别用浓度为10、75μmo1/L(接近各自的IC90值)的洛拉曲克处理0~60h.剂量曲线中,洛拉曲克作用时间36h,LoVo细胞剂量范围0~40μmol/L.Lo2细胞剂量范围0~125μmol/L.分别以流式细胞术法、Westemblot法检测两种细胞TS蛋白表达水平.结果两种细胞在经过洛拉曲克处理后,TS表达的时间和剂量曲线具有显著不同的动态规律.在时间曲线中,LoVo细胞TS蛋白的表达水平与对照相比呈持续升高的趋势,Lo2细胞TS蛋白的表达水平与对照相比先降低,24 h后TS蛋白表达水平逐渐回升,但至60 h尚未恢复至对照水平.在剂量曲线中,LoVo细胞TS蛋白的表达水平的变化呈峰形,以IC90值附近为高,Lo2细胞TS蛋白的表达水平,在低于IC90值的剂量点TS蛋白水平降低程度相似,高于IC90值的剂量处理后TS水平随剂量的升高而下降.结论洛拉曲克可以产生TS诱导现象,不同细胞在洛拉曲克作用后TS动态表达的差异是细胞耐药性不同的原因之一.

    作者:李亦蕾;吴曙光 刊期: 2004年第08期

  • PcDNA4/His C-MBL表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

    目的构建PcDNA4/His C-MBL表达载体,在哺乳细胞中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL).方法应用PCR从含有中国人野生型MBL cDNA的质粒pGEM-MBL中扩增目的基因片段,将其克隆至PcDNA4/His C真核表达载体.经酶切及测序鉴定后,以电穿孔法转染CHO细胞,以RT-PCR分析其mRNA表达,通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,以其为免疫原免疫小鼠后取鼠血清进行ELISA检测分析目的蛋白的免疫活性.结果从pGEM-MBL中扩增得到约750 bp的cDNA片段,构建成重组载体经酶切出现约5 100和750 bp片段,测序鉴定与预期的完全一致.RT-PCR证实转染细胞有MBLmRNA表达,纯化蛋白经SDS-PAGE电泳可见约29000、58 000和87 000条带,其中29 000蛋白带可与6-His抗体反应.纯化蛋白免疫小鼠所获抗血清ELISA效价是1:819 200,与天然人MBL和重组MBL三聚体糖识别域反应的ELISA效价均为1:25 600.结论获得了表达中国人MBL的CHO细胞株和重组人MBL,为MBL分子的进一步研究提供了条件.

    作者:白志军;张丽芸;林佐贤;卢晓;陈政良 刊期: 2004年第08期

  • 广东汉族人群HLA-CW多态性及单体型分析

    目的检测广东汉族人群HLA-Cw及HLA-A、B、DRB1基因频率,分析该人群HLA-Cw等位基因多态性及其单体型特点.方法骨髓移植供者185例,抗凝血提取DNA,半量全自动PCR-RSSO分型检测HLA-A、B、Cw、DRB1基因型.结果在分辨水平检出Cw等位基因11个,其中分布频率较高的依次为:Cw*03(0.2580)、Cw*07(0.1887)、Cw*01(0.1732)、Cw*08(0.1070).统计分析呈现显著连锁不平衡的HLA-Cw-A单体型7个,HLA-Cw-B单体型20个,HLA-Cw-DRB1单体型10个.结论广东汉族群体HLA-Cw基因具有较为丰富的多态性,其与HLA-A、B、DRB1间连锁不平衡单体型具有地区性遗传特征.

    作者:马红京;肖露露;尹晓林;郭坤元;叶欣 刊期: 2004年第08期

  • 人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

    目的在原核中高效表达及活性鉴定重组人survivin蛋白分子.方法应用RT-PCR的方法得到survivin的cDNA,并构建成pBV220-survivin原核表达质粒,将其导入E.coli B121(Gold)中,诱导表达survivin蛋白.通过DEAE SepharoseFastFlow离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛二步柱纯化以获取目的蛋白.用Western blotting检测表达产物.结果PT-PCR产物经测序分析与预期结果完全一致,表达质粒在E.coli B121(Go1d)中得到高效表达,表达的survivin蛋白占总蛋白含量的30%以上,表达产物以包涵体的形式存在.通过离子交换柱和分子筛二步柱纯化及复性后获得的目的蛋白,其纯度达到95%以上.Western blotting证明表达产物具有特异性.结论获得了较高纯度的survivin蛋白,为进一步深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具.

    作者:别俊;孙茂盛;孙强明;郑建平;孙雯佳 刊期: 2004年第08期

  • 肺结核住院病人延误诊断原因458例分析

    目的探讨住院肺结核病人延误诊断的原因.方法对我所1999年1月~2003年12月住院的458例入院前延误诊断肺结核患者进行回顾性分析.结果与结论延误诊断的原因为:(1)患者对某些呼吸系统症状未引起重视,延误就诊时间;(2)首诊医师仅依靠胸部X线检查,忽视了痰菌及其它检查;(3)非专科医师对因症就诊患者忽略了结核病的存在.

    作者:董秋兰;李艳明;吴东玲;郭红革;魏长春 刊期: 2004年第08期

  • 1,25-二羟维生素D3对高危角膜移植急性排斥反应及角膜新生血管的影响

    目的研究药物1,25-二羟基维生素D3(二羟维D3)在高危角膜移植模型中对免疫排斥反应及新生血管生长情况的影响,揭示1,25-二羟维D3作为免疫抑制剂在角膜移植中的治疗作用及机制.方法建立大鼠高危角膜移植模型,按不同浓度的1,25-二羟维D3(1×10-5和1×10-7mol/L)及环孢霉素A(CsA)分组,连续用药2周,观察移植物排斥情况并于术后4、7、14 d取材行原位杂交等实验,分析各组细胞因子:白介素1α(IL-1α)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA水平的变化情况.结果在1,25-二羟维D3作用下,高危角膜移植物的存活时间明显延长;新生血管生长受抑制;合用CsA后效果更明显.原位杂交实验证实1,25-二羟维D3能显著抑制植片IL-1α、TNF-αmRNA表达(P<0.01);对VEGF表达无直接影响.结论1,25-二羟维D3能有效地抑制新生血管生长及角膜移植急排期的免疫哌排斥反应,机制可能包括对前炎症因子(IL-1α、TNF-α)生成的抑制作用,而对VEGF无明显直接作用.

    作者:党森涛;陆晓和;周瑾;白浪 刊期: 2004年第08期

  • 猫颅脑火器性伤早期软脑膜血管管径及血流量变化

    目的研究猫在低速弹所致火器性颅脑损伤(CMW)后软脑膜微循环的改变.方法用气枪制作猫CMW模型,观察损伤前后软脑膜微血管的管径(D)、血流速度(V)、血流量(Q)及脑组织的病理学变化.结果(1)软脑膜细动脉Da、Va和Qa在伤后5~20 min期间明显降低,45 min后逐渐恢复,并且Qa和Da超过伤前水平.(2)伤后软脑膜细静脉Dv即超过伤前水平,而Vv伤后一直偏低,Qv在45min后升高超过伤前呈淤血状态.结论(1)CMW后出现微循环障碍,导致脑缺血缺氧,引起神经功能障碍;(2)CMW45 min后挫伤区、震荡区脑微循环出现代偿性微血管血流量增加,进一步导致缺血后再灌流损伤.

    作者:王凡;陈长才;毛伯镛;游潮;徐如祥 刊期: 2004年第08期

  • 鼻咽癌调强放疗和常规放疗受照剂量对比分析

    目的研究鼻咽癌常规放疗和调强放疗(IMRT)受照剂量的差异.方法用放疗计划系统分别进行鼻咽癌常规放疗和调强放疗计划设计,计算肿瘤量70 Gy时正常组织受照剂量-体积直方图和所需照射的总跳数.用X射线能量为6MV的加速器实施放疗计划.根据方野散射线和漏射线剂量率的测量值和总跳数,估算射野外不同距离正常组织所受辐射剂量.结果调强放疗射野内正常组织受照剂量低于28 Gy的体积是常规放疗的1.43~1.81倍,而高于35 Gy时,受照体积仅为常规放疗的0.73~0.30倍;射野外正常组织所受散射线和漏射线照射剂量的估计值约为常规放疗的2倍.结论鼻咽癌常规放疗与调强放疗相比,正常组织受照剂量和受照体积具有成倍差异,调强放疗漏射线和散射线是常规骀放疗的2倍.

    作者:张书旭;徐海荣;林生趣;李文华 刊期: 2004年第08期

  • 广东汉族人纤溶酶原激活剂抑制物-1基因4G/5G多态性与2型糖尿病肾病的相关性

    目的探讨纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)基因4G/5G多态性与广东汉族人2型糖尿病肾病(DN)发病的关系.方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析,对147例病史7年以上的2型糖尿病患者[其中DN患者77例,糖尿病非肾病(DNN)患者70例]和26名健康人进行了PAI-1基因4G/5G多态性分析.结果DNN组PAI-1基因的4G/4G基因型、基因频率显著高于DN组(x2=13.008,P<0.01);与5G/5G基因型相比,DNN组PAI-1基因4G/4G型对DN组的比数比为1.447,95%的可信区间:0.533~3.934(P<0.05),差异有显著性.而DN与DNN组PAI-1基因4G等位基因频率无显著差异(x2=1.22,P>0.05);结论PAI-1基因4G/4G基因型与广东汉族人2型DN的发病有关联,4G/4G基因型广东汉族2型糖尿病人易发生DN.

    作者:刘仕群;薛耀明;杨光彩;何飞英;赵小山 刊期: 2004年第08期

  • 犬膈神经离断后不同时期呼吸肌能量代谢的改变

    目的研究犬单侧膈神经离断后不同时期呼吸肌腺嘌呤核苷酸含量变化.方法选取8只成年健康杂种犬,离断其左侧膈神经,分别取其同侧肋间肌和膈肌组织,用高效液相色谱法测量膈神经离断前及离断后1、2个月呼吸肌中腺嘌呤核苷酸含量.结果犬肋间肌三磷酸腺苷(ATP)的含量三个时间组相比均无差别;而二磷酸腺苷(ADP)的含量上升,膈神经离断后2月组与离断后1月组相比,有统计学差别(P<0.05);犬肋间肌总腺苷酸(TAN)含量以膈神经离断后1月组为低,但并无统计学差别;肋间肌腺苷酸能荷(AEC)以膈神经离断后1个月为低,与离断前组和离断后2月组相比,均有统计学差别(P<0.05).犬的膈肌ATP、ADP及TAN、AEC含量在膈神经离断后2个月分别为:9.05±12.70,2.99±2.57,14.72±13.98,0.57±0.29;与膈神经离断前及离断后1个月相比,有统计学意义(P<0.05).结论犬膈神经离断后膈肌能量代谢明显下降,肋间肌有一定程度代偿.

    作者:田建昌;陈钢;肖飞;马俊杰;蔡瑞君 刊期: 2004年第08期

  • 湿热环境猫颅脑火器伤早期脑微循环及血脑屏障的变化

    目的研究湿热环境对猫颅脑火器伤早期脑微循环的影响,为临床治疗提供实验依据.方法24只成年猫用改良Carey法制作猫颅脑火器伤模型后,随机分为两组,每组12只,放入温度和相对湿度分别为25℃和50%,35℃和85%仿真模拟气候舱.通过脑微血管形态学及通透性和周围组织病理变化的观察,测定生命体征代偿指标、微血管中流动血液流变学特征和血脑屏障的变化来反应脑微循环的变化.结果全部动物无死亡.两组动物在脑微血管形态学及通透性和周围组织病理变化显著;在生命体征指标、血液流变学特征和血脑屏障的损害程度上存在显著差异.结论湿热环境对颅脑火器伤的早期脑微循环有显著影响,是颅脑火器伤的二次创伤.

    作者:马德选;徐如祥;朱红胜 刊期: 2004年第08期

  • 止血气雾剂对动脉破裂伤口的止血研究

    目的观测并评价止血气雾剂对肢体动脉破裂伤口的止血效果.方法剪断30头猪的共30条股动脉,按照向伤口喷洒止血气雾剂前是否辅助其他止血方法分为:指压止血+止血气雾剂、止血带止血+止血气雾剂和单纯喷止血气雾剂止血这3种方法制作动脉破裂止血模型,每种模型均制作10个,术后12 h内观察止血效果.结果止血带组的止血成功率为90%,指压法组的止血成功率30%,单纯喷止血气雾剂的止血成功率为10%.结论对于肢体动脉破裂伤口,采用先扎止血带暂时止血,之后喷洒止血气雾剂,10min后放松止血带的止血方法成功率高,是首选的止血方法.

    作者:孙鸿涛;裴国献;王运斗;张洪涛;张敬良 刊期: 2004年第08期

  • 高压交变电磁场对脑卒中康复的影响

    目的探讨高压交变电磁场对脑卒中病人康复治疗的临床治疗的效果及机制.方法选择脑卒中病人115例,分为治疗组55例和对照组60例,对比分析治疗前后患者血清脂蛋白及其亚组分和血液流变学指标的变化,以Barthel指数和功能独立性评定法(FIM)进行康复评定.结果治疗组显效29例;好转24例,无效2例,与对照组比较P<0.05;治疗后血清甘油三酸酯(TG)、总胆固醇(Tc)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)降低,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)浓度升高,Tc/HDL-c、LDL-c/HDL-c比率降低,降低了全血和血浆粘度,与对照组比较P<0.01;治疗组患者的Barthel指数增加了(38.4±5.3),与对照组比较P<0.05;治疗组患者的FIM评分与对照组比较增加了(34.7±5.3),与对照组比较P<0.0l;治疗组患者一年内脑卒中再发率下降明显,与对照组比较P<0.05.结论高压交变电磁场能改善脂蛋白代谢,改变血液流变学性质,提高脑卒中患者ADL能力及功能独立性,对脑血管疾病有显著的防治作用.

    作者:邓爱文;袁雪光;魏东;张建宏;冉春风;王敏 刊期: 2004年第08期

  • 原位肝移植术后并发症18例临床分析

    目的探讨原位肝移植术后并发症的诊治经验.方法回顾性分析我院18例次原位肝移植(其中2例再次肝移植)病人术后各种并发症的诊治经过.结果对16例患者(5例终末期肝硬化、7例原发性肝癌、l例肝癌术后肝功能衰竭、l例肝豆状核变性、l例慢性肾功能衰竭合并肝炎后肝硬化、1例急性暴发性肝功能衰竭)进行原位肝移植.手术成功12例,术后长存活已超过4年.术后并发症包括:腹腔内出血3例、脑血管病变2例、肺部感染6例、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)2例、肝上下腔静脉狭窄2例、肝动脉血栓形成l例、胆道结石或胆泥3例、胆漏1例、急性排斥反应2例、慢性排斥反应2例、急性肾功能衰竭2例.围手术期死亡6例,直接死亡原因:脑出血1例、ARDS 1例、急性肾功能衰竭1例、肝动脉血栓1例、急性排斥反应l例、肝功能衰竭1例.结论肝移植围手术期采取合理的防治措施能有效减少肝移植术后并发症的发生,对肝移植术后并发症的及时诊断和正确处理是提高肝移植成功率的关键.

    作者:苏树英;陈焕伟;甄作均;许卓明;计勇 刊期: 2004年第08期

  • 人全长PLCγ1基因真核表达载体的构建及鉴定

    目的构建人全长PLCγ1基因真核表达载体,以便进一步研究PLCγ1的作用及其机制.方法自行设计一对带有HindⅢ和NotⅠ酶切位点的引物,采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCγ1 cDNA(3 878 bp),纯化后,经HindⅢ-NotⅠ酶切,插入真核表达载体pLNCX2中,构建重组质粒pLNCX2/PLCγ1.通过PCR,限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定.同时经瞬时转染后,利用RT-PCR及Western blotting转染后LoVo细胞中PLCγ1的表达.结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3 878bp).重组质粒经HindⅢ-Not Ⅰ酶切后,得到3 878bp(PLCγ1基因)及6 100bp(载体pLNCX2)两个片段,同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后,得到约4300bp及约8 500bp两个片段,与预期一致.DNA测序也证实了重组质粒的正确.经RT-PCR和Western blot分析证实转染pLNCX2/PLCγ1的LoVo细胞中PLCγ1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞.结论成功构建了人全长PLCγ1基因真核表达载体pLNCX2/PLCγ1,为进一步研究PLCγ1的作用奠定了基础.

    作者:李秀梅;邓凡;曾位森;华亮;陆地;李明;王宏;刘忠英;罗深秋 刊期: 2004年第08期

  • 广东地区围绝经期妇女健康状况和需求调查

    目的了解广东地区围绝经期妇女的健康状况和健康需求,从而进一步探索围绝经期、老年期保健模式和方法,为政府部门提供决策依据.方法采取分层整群抽样的方法,将广东省按地理地貌分为5层,共抽取了5个地级市(代表城市)和4个县级市(代表农村).对40~65岁的4 500个围绝经期妇女进行调查.结果广东地区妇女自然绝经年龄48.6岁,其中城市48.9岁、农村48.3岁.现患病率39%,其中城市38.5%、农村39.5%,两者比较无显著性差异.前6位现患疾病的顺位是骨关节疾病(12.5%)、高血压(9.2%)、子宫肌瘤(6.8%)、胃或十二指肠溃疡(5.2%)、心脏病(2.7%)和糖尿病(2.2%).骨关节疾病中膝关节疾病(34.3%)、腰椎疾病(32.8%)是高发病,骨折患病率2.5%.围绝期综合征的患病率为68.1%,为痛苦的症状是失眠、肌肉骨关节疼痛、烦躁、头晕,以心理症状(86.8%)和躯体症状(86.0%)为主;出现围绝经期综合征未就医者占71.2%,到妇产科就医者仅20.5%,以服用中药为主(53.9%),应用性激素疗法者1.4%(城市1.8%、农村1.0%).无健康体检者37.8%,有过健康体检者62.2%,其中城市80.4%、农村44.4%,城市明显高于农村.结论围绝经期综合征及相关疾病严重地影响围绝经期妇女的身心健康,这一人群的保健、医疗存在广泛需求,应该全方位地进行防治.

    作者:田丰莲;杨冬梓;张小庄;赵庆国;詹新林;李容汉;穆荔;江雪芳;李洁明 刊期: 2004年第08期

  • 高温高湿环境下颅脑火器伤的基础与救治研究概论

    较系统地介绍了高温高湿环境下颅脑火器伤的病理生理改变特点,指出高湿高湿环境是引起脑二次创伤的重要因素,是导致伤病员早期伤死的主要原因之一.提出加强这一军事医学课题研究、提高救治成功率的重要性.

    作者:徐如祥 刊期: 2004年第08期

  • 补阳还五汤对脑缺血大鼠nNOS免疫阳性神经元的影响

    目的探讨补阳还五汤对大鼠持续性局灶性脑缺血后脑组织内神经元型一氧化氮合酶(nNOS)免疫阳性神经元表达的影响.方法动物分为正常对照组,模型对照缺血1、4、10h组,补阳还五汤预处理缺血1、4、10h组.局灶性脑缺血模型由线栓法阻塞大鼠大脑中动脉(MCAO)制成,免疫组化SABC法测定大鼠脑缺血后,不同脑区在不同时间段的nNOS免疫阳性神经元表达的变化.结果缺血侧各脑区内nNOS免疫阳性神经元表达较正常对照组升高(P<0.05),随时间延长而递增,在大脑皮层纹状区与尾壳核表达增加程度高.补阳还五汤预处理缺血4、10 h组大脑皮层纹状区nNOS免疫阳性神经元表达(170.80±21.71、189.20±18.53)比模型组同时段表达(244.60±12.44、363.00±24.82)显著性降低(P<0.05);补阳还五汤预处理缺血1、4、10 h组尾壳核nNOS免疫阳性神经元表达(127.33±19.83、215.20±38.80、191.20±22.39)比模型组同时段表达(138.67±13.99、266.40±29.25、373.20±31.55)显著性降低(P<0.05).早期即起效,并随缺血时间延长而递增.结论提示补阳还五汤能抑制缺血后脑组织内早期nNOS活性的升高,对缺血后脑组织具有早期保护作用.

    作者:廖春来;佟丽;陈育尧 刊期: 2004年第08期

  • 亚低温对颅脑损伤颅内压及脑氧代谢影响的研究

    目的探讨重型脑损伤患者亚低温(33~35℃)治疗前后颅内压(ICP)、脑组织氧分压(PO2)的变化及临床意义.方法32例重型颅脑损伤患者分为亚低温组及对照组,放置ICP脑组织PO2光纤探头,持续监测ICP及脑组织PO2.结果亚低温治疗24h后ICP逐渐下降,脑组织PO2逐渐上升,与对照组比较差异有显著性(P<0.05).结论亚低温治疗能明显降低重型颅脑损伤患者ICP,改善脑组织氧代谢,使患者死亡率及致残率降低.

    作者:林源泉;贾军;刘文锋;张浚 刊期: 2004年第08期

  • 新生儿紫绀型先天性心脏病的彩超诊断价值

    目的探讨彩超对新生儿紫绀型先天性心脏病的诊断价值.方法对149例青紫的新生儿进行彩超检查,诊断紫绀型先心病25例并分析其疾病类型.结果25例紫绀型先心病中存在大动脉转位、法乐四联症、单心室、永存动脉干等复杂畸形,其中大动脉转位多见,其次为法乐四联症,单心室位居第3.结论彩超可作为青紫新生儿先心病的常规筛查手段.

    作者:李彬;龙振荣;刘卓华 刊期: 2004年第08期

南方医科大学学报杂志

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主管:广东省教育厅

主办:南方医科大学