宋淑霞；李妙颖；侯志宏；刘福英；吕占军
目的:建立小鼠NK细胞的分离及培养扩增的方法.方法:用两步黏附分离法和磁珠活化的细胞分选(MACS)法,从小鼠脾脏的单个核细胞(MNC)中分离NK细胞,计数所得细胞的总数,并用FITC-抗小鼠CD3和PE-抗小鼠NK1.1单克隆荧光抗体染色后,用流式细胞仪(FACS)检测NK细胞的纯度.以YAC-1细胞为靶细胞,用MTT比色法检测NK细胞的杀伤活性.结果:将两步黏附分离法分离的2×107个脾MNC培养5、10、15、20d,计数细胞的总数并检测CD3-NK1.1+细胞百分率,分别为0.5×107、1.4×107、2.6×107、3.0×107和18.36%、43.44%、55.68%、60.03%.效靶细胞25:1时,NK细胞的杀伤率分别为54.38%、66.54%、79.38%和83.86%,明显高于脾MNC(41.93%)(P＜0.01).MACS法纯化前后细胞的总数和CD3-NK1.1+细胞的百分率,分别为1.0×108、1.5×106和2.54%、93.60%;但纯化后的细胞在体外培养20d时,只扩增到1.9×106个.结论:用两步黏附分离法分离的小鼠NK细胞,培养2～3wk可获得大量的NK细胞,纯度可达55%～60%;在效靶细胞为25:1时,NK细胞对YAC-1细胞的杀伤率约为80%.
作者：杨志刚；曾耀英；何贤辉；王通；江逊；唐德燊 刊期： 2005年第03期
目的:制备高效价的鼠源性抗人μ链单克隆抗体(mAb),并建立可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法.方法:以人IgM全分子免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,用间接ELISA法筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗μ链mAb的杂交瘤细胞株.mAb的特性(效价、Ig亚类、特异性及相对亲和力)采用ELISA及Western blot法鉴定.以纯化的mAb包被建立ELISA捕捉法,并用于可疑乙脑患者标本中特异性IgM抗体的检测.结果:筛选到1株可稳定分泌抗人μ链mAb的细胞株2E5.mAb腹水的ELISA效价为1×10-6,Ig亚类(型)为IgGl(κ),相对亲和力为1×10-5.Western blot结果显示mAb2E5仅与IgM的μ链结合,Mr为75000.以辛酸-硫酸铵法纯化的mAb2E5包被,建立了ELISA捕捉法,用于30份乙脑患者血清IgM的检测,敏感性及特异性良好.结论:成功地制备1株抗人μ链mAb2E5,建立了可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法.
作者：杨敬；丁天兵；任君萍；宋建华；马文煜 刊期： 2005年第03期
目的:确定抗人CD38分子单克隆抗体(mAb)1C6识别的抗原表位所在区域.方法:分别构建缺失人CD38不同表位的重组质粒,用IPTG诱导表达融合蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot分析.结果:1C6不能识别缺失第220～241位氨基酸的D4片段,而对其他的缺失突变体均可识别.结论:mAb 1C6抗体识别的抗原表位位于CD38分子胞外段第220～241位氨基酸.
作者：温新宇；胡美茹；黎燕；戚中田；沈倍奋 刊期： 2005年第03期
目的:探讨内皮素-1(ET-1)作为一种早期放射性肺损伤诊断及病情变化的血清学标志物的可能性.方法:将190只雌性SD大鼠随机分为正常对照组(c组)和实验组,即:放射组(R组)、氟代他汀(Flu)干预组(Flu组)、维甲酸干预组(Ra组)及地塞米松(Dex)干预组(Dex组).实验组大鼠麻醉固定后,用直线加速器全胸照射15Gy1次,剂量率为2Gy/min,距离为1m.从照射后次日开始,Flu组经胃灌服Flu(20mg·kg-1·d-1),Ra组灌服Ra(20mg·kg-1·d-1),Dex组灌服Dex(3.33mg·kg-1·d-1),c及R组均灌服等量的生理盐水.各组分别于照射后5、15、30、60d,将大鼠分批断头或经心内穿刺取血,分离血清;同时切取肺组织,用放射测定法(RIA)分别测定ET-1,层黏连蛋白(LN)及透明质酸(HA)的水平;同时观察肺部的病理变化.结果:与c组相比较,R组大鼠血清ET-1的水平于照射后第5天开始升高(P＜0.05),尔后随着放射性肺损伤的加重逐渐升高,于照射后60d检测达高峰.R组大鼠血清LN的水平于照射后30d开始升高,HA于照射后60d开始升高.R组大鼠血清ET-1水平的升高明显早于其他各组,且同放射性肺损伤的病理变化的程度相关.结论:血清ET-1可作为放射性肺损伤早期诊断及动态监测病情变化的一种标志物.
作者：戚好文；叶江枫；宋立强；陈卫强；梁军；穆德广 刊期： 2005年第03期
目的:检测结缔组织生长因子(CTGF)在小鼠肺内的表达,并探讨其在肺纤维化中的意义.方法:通过向气管内滴入博莱霉素建立小鼠肺纤维化模型.用免疫组化染色方法检测不同时期肺组织中CTGF蛋白的表达;用RT-PCR检测CTGF mRNA的表达;用酸水解法测定肺羟脯氨酸的含量.结果:在正常小鼠肺组织中,CTGF蛋白和其mRNA几乎不表达;而在模型组的肺组织中表达明显升高(P＜0.01).CTGF蛋白表达于支气管/细支气管上皮细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞和肺成纤维细胞,表达量与肺组织中羟脯氨酸的含量呈显著的正相关(r=0.92,P＜0.001).结论:CTGF与肺纤维化的形成关系密切,CTGF检测可作为评价肺纤维化发生、发展的一种灵敏的指标.
作者：张雷；卢惠苹；赖国祥 刊期： 2005年第03期
目的:在大肠杆菌中分别表达3种Red蛋白,并制备兔抗Red蛋白的抗体.方法:从λ噬菌体基因组中,通过PCR分别扩增gam、bet和exo DNA的全长序列.将PCR产物克隆入非融合表达载体pDH2中,构建Red蛋白的高表达工程菌.通过温敏诱导表达3种Red蛋白(Bet、Exo和Gam),用PACTE薄层扫描检测目的蛋白含量.用3种Red蛋白分别免疫家兔制备抗血清,并以Western blot鉴定抗体的效价和特异性.结果:大肠杆菌中表达的Bet、Exo和Gam蛋白,分别占菌体总蛋白量的40.3%、49.2%和73.4%.3种抗血清的效价约为1:2000.Western blot分析显示抗血清具有较好的特异性.结论:成功地获得Bet、Exo和Gam3种蛋白,并分别制备了相应的抗血清.使用这3种抗血清,检测了3种蛋白在真核细胞中的表达和定位,为研究Red蛋白的同源重组奠定了基础.
作者：张晓楠；陈苏民；罗二平；黄勇；柴玉波；李云峰；陈南春 刊期： 2005年第03期
目的:探讨磷酸二酯酶(PDE)抑制剂对慢性阻塞性肺疾病(cOPD)患者外周血单个核细胞(PBMC)IL-8mRNA表达的影响及机制.方法:采集20例急性发作期COPD患者(A组)和15例正常人(B组)的PBMC.A组的每份PBMC分4组培养:A1组为空白对照,A2组和A3组分别加入100μmol/L及1mmol/L的非选择性PDE抑制剂茶碱,A4组加入选择性PDEⅣ抑制剂Rolipram.应用RT-PCR检测IL-8mRNA的表达,以免疫组化法检测NF-κB阳性细胞的百分率,用Western blot检测I-κB蛋白的含量.结果:(1)A1组PBMC中IL-8mRNA的表达及NF-κB阳性细胞的百分率,均显著高于B组;I-κB的水平显著低于B组(P＜0.01).(2)与A1组比较,A2组和A3组的PBMC中IL-8mRNA的表达无显著差异(P＞0.05);A4组IL-8mRNA的表达明显下降(P＜0.01).(3)与A1组比较,A2组NF-κB阳性细胞的百分率及I-κB的水平无显著差异(P＞0.05);而A3组的PBMC中NF-κB阳性细胞的百分率下降(P＜0.05),I-κB蛋白的水平无显著变化(P＞0.05).A4组PBMC中,NF-κB阳性细胞的百分率较A1组明显下降,I-κB蛋白的水平明显增加(P＜0.01).结论:COPD患者PBMC中IL-8mRNA的表达较正常增高,提示IL-8参与了COPD的发病过程;选择性PDEⅣ抑制剂Rolipram可抑制IL-8基因的表达,其作用机制可能与NF-κB阳性细胞百分率的下降有关.非选择性PDE抑制剂茶碱对IL-8基因的表达无明显影响.
作者：杨丹蕾；徐永健；李超乾；张珍祥；倪望 刊期： 2005年第03期
目的:构建含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体.方法:首先克隆FRT序列与HBsAg的融合基因FRT-HBsAg,然后将FRT-HBsAg亚克隆到pCI-neo的MCS中,构建表达载体pCI-FRT-HBsAg.以此载体转染CHO/dhfr-细胞,用1g/L的G418筛选抗性克隆.检测抗性克隆HBsAg的表达,筛选表达量高的克隆作为宿主细胞株,命名为CHO/dhfr-FRT+.将表达质粒pA-FRT HFLF和pOG44以1:9的质量比混合,取2μg转染CHO/dhfr-FRT+.转染48h后,换选择培养基(撤掉H、T)用96孔板进行克隆化,2wk后对长成的单克隆进行检测.筛选正确整合到CHO/dhfr-FRT+细胞中FRT位点的克隆,并不断提高MTX的浓度,进一步筛选表达量更高的克隆.在MTX的浓度为2×10-7mol/L时,获得稳定表达细胞株,其后的表达量为5mg/L.对此细胞株扩大培养后,收集上清并纯化,以纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE及Western blot和抗原结合活性的检测.结果:构建了高转录活性位点整合FRT序列的CHO/dhfr-细胞株,并在此细胞株中表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体,表达量为5mg/L.结论:构建了含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体,为用此系统表达抗体分子和其他蛋白分子奠定了基础.
作者：李建民；陈薇；贾秀杰；安小平；李冰；樊英茹；童贻刚 刊期： 2005年第03期
目的:体外折叠形成可溶性HLA-G1-抗原肽复合物,并研究其生物学功能.方法:以原核表达的可溶性HLA-G1的重链及轻链β2m,与人工合成的抗原九肽体外进行共折叠复性.将折叠产物通过Sephadex G-75层析柱纯化,经Western blot进行构象鉴定.探讨可溶性HLA-G1分子对NK细胞杀伤活性的影响,对混合淋巴细胞培养中T细胞增殖的影响,以及对活化T细胞凋亡的影响.结果:折叠产物可与mAb W6/32特异性结合,在Western blot的鉴定中呈阳性反应.可溶性HLA-G1可有效地抑制NK细胞的细胞毒作用,抑制混合淋巴细胞培养中T细胞的增殖,促进活化T细胞发生凋亡.结论:体外折叠成功地形成可溶性HLA-G1-抗原肽复合物,该复合物具有抑制NK细胞和T细胞的活性.
作者：杨敬宁；吴雄文；梁智辉；韩军艳；黄亚非；龚非力 刊期： 2005年第03期
目的:探讨绿色荧光蛋白(GFP)在环磷酰胺(CY)处理小鼠胸腺中的表达.方法:将质粒pEGFP-c3和梭华-SofastTM基因转染试剂按一定比例配制成转染液,经腹腔注入3组小鼠(每组15只)进行转染.转染24h后分别注射0.5、1、2mg/只的CY,并设对照组(15只).18h后称小鼠体质量,然后处死动物,无菌取胸腺并称重,用PBS洗出细胞,制成单细胞悬液,于荧光显微镜下观察GFP的表达情况.结果:GFP可在小鼠胸腺中表达,且GFP+细胞数与CY的剂量相关.高剂量的CY处理可导致胸腺明显萎缩、胸腺细胞总数及GFP+细胞数的减少.结论:转染质粒pEGFP-c3并经CY处理的小鼠及正常对照组小鼠的胸腺中均可表达GFP,但CY处理的小鼠胸腺中GFP的表达情况明显低于对照组小鼠.
作者：艾正亚；施用晖；乐国伟；虞泽鹏；王海松 刊期： 2005年第03期
目的:在大肠杆菌中表达ESP30蛋白,并制备兔抗ESP30抗体.方法:从嗜水气单胞菌基因组中扩增ESP30基因序列,并克隆入非融合表达载体pDH2中,在温度诱导下,表达目的蛋白,以表达的ESP30作为免疫原免疫家兔制备抗ESP30抗血清,抗体效价及特异性分别用ELISA和Westernblot法鉴定.结果:在大肠杆菌中高效表达相对分子质量(Mr)约为66000的ESP30蛋白.ELISA法检测抗血清的效价可达到1:128000,Western blot分析抗血清可与原核表达的ESP30蛋白特异结合.结论:成功地制备兔抗ESP30的抗血清,为进一步研究ESP30蛋白的结构和功能奠定了基础.
作者：张莹莹；李福洋；张文红；张健；黄勇；刘新平；药立波 刊期： 2005年第03期
目的:构建人端粒酶催化亚基(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的核心启动子调控的荧光素酶报告载体,检测其在肿瘤细胞及正常细胞中表达的差异.方法:提取人HeLa细胞的基因组,利用PCR技术克隆hTERT基因的核心启动子.将其插入荧光素酶报告载体中,经SacⅠ和Hind Ⅲ酶切和PCR鉴定后,转染肿瘤细胞及正常细胞,观察两种细胞中荧光素酶基因表达的差异.结果:hTERT基因的启动子调控的表达载体在肿瘤细胞中呈高效表达;而在正常细胞中的表达极低.结论:hTERT基因的启动子具有肿瘤特异性,有可能解决肿瘤基因治疗中的靶向性问题.
作者：韩明鲲；张惠中；成诗银 刊期： 2005年第03期
B淋巴细胞刺激物(B lymphocyte stimulator,BLyS,也称为BAFF、TALL-1、THANK及zTNF4)是1999年发现的TNF超家族中的新成员,与该超家族中的多数成员一样也表达于淋巴组织中,对免疫系统的发育和调节具有重要作用.BLyS作为B细胞的共刺激物,不仅参与了体液免疫的调控,如果强烈刺激B细胞增殖、分化并分泌大量免疫球蛋白[1-3];在T细胞介导的免疫应答中可能也发挥着重要作用[4].因此,BLyS的异常表达导致免疫功能紊乱,引起一些相关的免疫性疾病.
作者：石晓娟；毛伟平；张双全；姜平；赵洁明 刊期： 2005年第03期
目的:对不同剪接形式的小鼠era基因(mera)进行克隆、原核表达,并进行纯化,检测抗人Era蛋白抗体对于两种剪接形式鼠Era蛋白的特异性,为以后鼠Era蛋白的研究奠定基础.方法:采用两种剪接形式era基因的MBP融合表达载体(pMAL-meraW,pMAL-meraS),在大肠杆菌中进行表达,对其进行纯化,并应用Western blot鉴定了抗人Era蛋白抗体的特异性.结果:原核表达的MBP-mEraW、MBP-mEraS融合蛋白经过薄层扫描后发现其分别占菌体总蛋白的17%、19%;纯化后的融合蛋白纯度为67%和61%;用抗人Era蛋白抗体进行Western blot发现抗体特异性较好,适合两种剪接形式的鼠Era蛋白的检测.结论:利用原核系统高效表达了不同剪切形式的鼠era基因,并检测了兔抗人Era蛋白抗体对不同剪接形式鼠Era蛋白的特异性,为以后对鼠era基因的研究奠定了基础.
作者：董轲；陈苏民；纪宗玲；郑玉；陈南春 刊期： 2005年第03期
目的:研究短发夹RNA(shRNAs)对人端粒酶催化亚基(hTERT)表达的影响.方法:将编码针对hTERT的shRNA的寡聚核苷酸克隆入哺乳细胞shRNA表达载体pUC18U6形成pUC18U6ht,然后以脂质体法转染人HepG2细胞.被pUC18U6和表达抗绿色荧光蛋白shRNA的pUC18U6GFPsir转染的HepG2细胞作为对照.转染细胞的hTERTmRNA以实时定量RT-PCR定量测定.结果:与对照相比,shRNA可使hTERTmRNA的水平降低49%(P＜0.05).结论:shRNAs抑制了hTERT的表达.
作者：郭颖；宋天保；吴静；赵艳；李歧佩 刊期： 2005年第03期
目的:建立甲基苯基四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病模型小鼠,检测血浆IL-6和IL-1的水平,并探讨其与脑不对称的关系.方法:利用区分行为不对称的伸爪取食试验,将C57BL/6J小鼠区分为反映脑不对称的左利小鼠和右利小鼠.给小鼠腹腔注射MPTP25mg/kg,每日1次,连续5日,建立小鼠帕金森病模型,对照组注射等体积的生理盐水.后1次注射MPTP后1、3、14d杀鼠取血,采用ELISA检测各时间点小鼠血浆IL-6和IL-1的水平.结果:正常对照组血浆IL-6水平很低,而模型组小鼠在末次注射MPTP后14d,血浆IL-6的水平显著升高(P＜0.01).而且第14天右利小鼠血浆IL-6的水平高于左利小鼠IL-6水平(P＜0.05).正常对照组小鼠血浆IL-1的水平也较低,而模型组小鼠在末次注射MPTP后3d,血浆IL-1的水平显著升高(P＜0.05),而且左利小鼠的水平明显高于右利小鼠(P＜0.01).结论:IL-6和IL-1可能参与了MPTP诱导的C57BL/6J小鼠帕金森病的发生发展,并与脑不对称有关.
作者：申延琴；李康生；P.J.Neveu 刊期： 2005年第03期
目的:对比研究70岁以上老年和30～49岁成年患者体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)心脏手术术后炎性损伤的特点.方法:随机选取我院及第四军医大学西京医院心脏外科在2003-10～2004-10期间,实施CPB心脏手术的患者36例(≥70岁的老年患者和30～49岁成年患者各18例),记录患者的临床资料,并在患者手术诱导后、CPB结束后和手术结束后24h,分别采集血样,用ELISA法测定血浆TNF-α、IL-6和IL-8的含量.结果:老年患者中早期死亡2例(死亡率为11.1%),成年患者均无手术死亡.手术结束24h后,老年患者较之成年患者血浆TNF-α、IL-6和IL-8的含量明显增高(P＜0.01).结论:70岁以上老年患者CPB心脏手术后24h炎性损伤明显比成年患者严重,因此,设法减轻CPB术后的炎性损伤,或许对提高老年患者心脏手术的疗效具有更为重要的意义.
作者：侯晓彬；刘沙；易定华；肖明第 刊期： 2005年第03期
目的:检测培养的大鼠原代肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)是否表达IL-18Rα和IL-18RβmRNA.方法:以肾小管节段贴块法进行原代RTECs的培养.用免疫细胞化学染色法鉴定细胞的类型,用RT-PCR检测RTECs中IL-18RαmRNA及IL-18RβmRNA的表达.结果:免疫细胞化学染色法证实,原代培养的细胞均为RTECs,并表达IL-18RαmRNA和IL-18RβmRNA.结论:在RTECs中有IL-18RαmRNA和IL-18RβmRNA的表达,为探讨IL-18R在肾间质纤维化中提供了实验依据的作用.
作者：杜胜华；刘华锋；唐德燊；陈孝文 刊期： 2005年第03期
目的:制备小鼠抗人c-erbB2mAb,并进行特异性鉴定.方法:应用计算机软件分析人源c-erbB2抗原表位,人工合成羧基端含优势表位的13肽,与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联后,免疫BALB/c小鼠.取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次经HAT选择培养、间接ELISA法、克隆化和免疫组化染色法筛选出稳定分泌抗天然人源c-erbB2mAb的杂交瘤细胞株.用交叉反应试验和阻断试验检测mAb的特异性.结果:获得1株可稳定分泌抗天然人源c-erbB2抗体的杂交瘤细胞株.该mAb与已知的c-erbB2抗原阳性的乳腺癌标本起反应;与其他不表达c-erbB2分子的细胞不起反应.用合成的13肽阻断后,失去与c-erbB2抗原的反应性.结论:用合成的13肽作为免疫原成功地制备出1株抗c-erbB2的mAb.
作者：宋淑霞；李妙颖；侯志宏；刘福英；吕占军 刊期： 2005年第03期
全套抗体库为制备抗任意抗原的人源抗体提供了来源,且具有重要的基础研究和应用价值.因此,构建高质量的抗体库一直是抗体工程研究的热点.全合成抗体库技术以其可控性、可操作性强,组成成分明确,设计灵活并能满足高通量筛选的要求等特点,得以迅速发展和广泛应用[1].随着对抗体结构和功能认识的深人,人们越来越多地利用蛋白质工程手段进行优化设计,来提高抗体库中抗体分子的表达能力和稳定性,通过提高抗体库中功能性抗体的比例,从而有效地提高抗体库的质量.
作者：王尚资；尹长城；林正红；王祥斌；刘晶；管华诗；黄华樑 刊期： 2005年第03期
细胞与分子免疫学杂志
主管:中国免疫学会；第四军医大学
主办：陕西省免疫学会,中国免疫学会
