学术投稿

结核分枝杆菌标本的不同处理方法对PCR扩增敏感性的影响

周步全;朱建峰;王迎春;王义凤;董川

关键词:荧光定量聚合酶链反应, 结核分枝杆菌, 标本处理, 胰酶, 红细胞裂解液, 十二烷基硫酸钠
摘要:目的探讨检测标本中血红蛋白(Hb)浓度对PCR扩增管中Taq酶活性的影响及消除影响的方法;探讨胰酶消化痰液的应用价值;比较淋巴细胞分离液、红细胞裂解液、十二烷基硫酸钠(SDS)溶血液处理全血标本对检测结果敏感性的影响;观察SDS在结核分枝杆菌DNA(TB DNA)提取液中存在的价值及对Taq酶的影响.方法将经梯度稀释的Hb标准品与结核分枝杆菌(TB)定值质控品混匀制备成待检标本进行PCR检测;将定值Hb标准品与TB质控品混匀制备成待检标本,观察提取时100℃煮沸时间对Hb抑制Taq酶能力的影响;将结核患者的痰液分成两管,分别用4 g/dl NaOH消化、1 g/dl胰酶消化、1 g/dl胰酶消化+4 g/dl NaOH处理,比较PCR检测结果的敏感性;将结核患者的外周抗凝血分别用淋巴细胞分离液、红细胞裂解液、SDS溶血剂处理,比较PCR检测结果的敏感性;用10 g/LSDS、1%(v/v)Triton、1 g/LSDS的1%(v/v)Triton、0.5 g/L SDS的1%(v/v)Triton提取液对相同的TB质控品进行TB DNA提取,观察PCR检测结果敏感性;56份痰液、34份全血按痰液、全血标本的方法处理,进行PCR扩增,比较检测结果的阳性率.结果当Hb≥10-5g/L时,Hb对Taq酶的抑制作用随其浓度的增加而增强;提取时100℃煮沸40 min与煮沸10 min的对照管结果完全一致;痰液标本处理方法的敏感性顺序为:胰酶消化+NaOH处理>胰酶消化>NaOH消化;全血标本处理方法的敏感性顺序为:红细胞裂解液法=淋巴细胞分离法>SDS溶血法;提取方法PCR检测结果敏感性顺序为:0.5 g/L SDS的1%(v/v)Triton>1%(v/v)Triton>1 g/L SDS的1%(v/v)Triton>10 g/L SDS,SDS对Taq酶的抑制作用随其浓度的增加而增强.56份痰标本按上述方法处理的阳性率分别为57.1%(32/56),82.1%(46/56),91.0%(51/56),通过配对资料卡方检验,胰酶消化和胰酶消化+NaOH处理与NaOH消化法之间具有显著性差异(P<0.005),胰酶消化和胰酶消化+NaOH处理之间差异无显著性(0.1<P<0.25);34份全血标本按上述方法处理的阳性率分别为79.4%(27/34),79.4%(27/34),47.0%(16/34),通过配对资料卡方检验,红细胞裂解液法和淋巴细胞分离法与SDS溶血法之间具有显著性差异(0.005<P<0.01).结论检测TB DNA标本的预处理有必要规范化.
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    目的优化实验程序以拓展免疫比浊法定量检测D-二聚体的检测范围.方法分别以未稀释样本及预稀释样本方式在CA1500全自动血凝仪上建立两套程序.应用D-二聚体标准品分别建立两套程序相应的定量标准曲线,一条为未稀释标准曲线,另一为预稀释标准曲线.在两条标准曲线模式下,分别对D-二聚体高值质控血浆和临床收集的43例D-二聚体异常升高血浆样本进行D-二聚体测定.结果未稀释标准曲线与预稀释标准曲线对应的D-二聚体检测线性范围分别是124~3 980μg/L和498~7 960μg/L.在未稀释标准曲线模式下,上述样本的D-二聚体均不能直接测出;而在预稀释标准曲线模式下,所有样本D-二聚体均可直接测出,其中D-二聚体高值质控血浆的D-二聚体测定结果为3 328±194μg/L,43例临床样本D-二聚体结果在1 386~6 185μg/L之间,平均为3 009±1 497μg/L.结论在应用免疫比浊法进行D-二聚体测定中,另外建立一套预稀释程序可以拓展免疫比浊法定量检测D-二聚体的检测范围,而且可以较好地解决D-二聚体异常升高样本不能直接测定的问题.

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    新型隐球菌墨汁染色检测法,一直以来以其操作简便、成本低而延用,尤其在疑为中枢神经系统隐球菌感染的脑脊液标本检测时.但在实际应用中,墨汁染色法受杂质及细胞成分干扰大,检出率低,特别在中枢感染的初期及恢复期,隐球菌数量较少,易漏检.现介绍一种简便快速的特殊染色法,提高隐球菌的检出率,供同行参考.

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    作者:骆泉娥;胡熙金 刊期: 2005年第06期

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    IFMA是时间分辨免疫荧光分析测定法的简称,是继免疫吸附试验和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术.它以免疫学反应为基础,将抗原与抗体的特异性反应与金属铕标记抗体作用相结合,再加入增强液将复合物标记抗体上的Eu3+解离到溶液中,并与增强液中有效成分形成高荧光强度的螯合物,其荧光强度与溶液中的待测物质的浓度成正比.

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    目的采用荧光产物增强逆转录酶活性分析(STF-PERT),建立逆转录酶活性荧光定量方法,用于临床标本和献血员中逆转录病毒的检测.方法用荧光产物增强逆转录酶活性分析方法检测500份献血员血液样本;同时测定此方法的敏感性.结果将AMV逆转录酶经连续梯度稀释后,经PCR循环反应,得到与理论值完全相符合的PCR荧光值曲线.500份献血员样本有19份逆转录酶(RT)活性阳性,阳性率为3.8%;用常规筛选方法检测,有1份HIV可疑结果,2份HCv阳性,5份HBV阳性,共8份,筛检率为1.6%.结论常规的献血员血样筛选方法,并不能完全包含所有被检测献血员血样中的逆转录病毒;STF-PERT对及时发现逆转录病毒感染,提高临床输血安全性有着十分重要的意义.

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  • 19例地中海贫血的基因诊断

    目的探讨遗传性血液病地中海贫血(mediterranean anemia)的基因诊断.方法运用聚合酶链式反应(polymerase chin reaction,PCR)、反向斑点杂交法(reverse dot blot,RDB)对不明原因的33例溶血性贫血、重型贫血患儿进行基因分型、突变点位检测.结果通过对33例全血标本的检测,19例确诊为地中海贫血,其中4例为α-地中海贫血,15例为β-地中海贫血.β-地中海贫血患儿中,男11例,女4例;α-地中海贫血患儿中,男3例,女1例;19例患儿中单基因位点突变有16例,双重基因位点突变有3例.结论运用基因检测技术对血液病地中海贫血的临床诊断及治疗具有重要意义.

    作者:胡双林;倪林仙;樊茂;奎莉越 刊期: 2005年第06期

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    作者:周步全;朱建峰;王迎春;王义凤;董川 刊期: 2005年第06期

  • 荧光定量聚合酶链反应检测人乳腺癌C-erbB2基因扩增及过度表达的研究

    目的建立荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测C-erbB2基因表达水平,探讨其在乳腺癌诊断和治疗监测中的应用.方法建立FQ-PCR法,并以β2-微球蛋白为内对照测定15名健康女性体检者、30例良性乳腺疾病患者和81例乳腺癌患者外周血中C-erbB2的表达量.结果C-erbB2表达水平在正常对照组和良性乳腺疾病组间差异无显著性意义(P>0.05),乳腺癌组均高于前两组(P<0.05),β2-微球蛋白在三组间差异无显著性意义(P>0.05).81例乳腺癌患者阳性率为50.6%,良性乳腺疾病组为0.C-erbB2表达与患者年龄和肿瘤大小和类型无关(P>0.05),与乳腺癌临床分期、组织学分级以及腋淋巴结转移相关(P<0.05).结论FQ-PCR技术是高度灵敏、高度特异的快速定量检测C-erbB2方法,可有效地诊断乳腺癌并对其疗效、转移和预后进行监测.

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    作者:邬旭群;鲍自谦;陈云龙 刊期: 2005年第06期

现代检验医学杂志

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