杨秋霞；姜洪池；李斌；郗雪艳；刘玉；王兰；吕雪莹；谷金宇；李殿俊
目的:构建携带截短型转位肽重组抗体/颗粒酶B基因的真核表达载体, 并将其在HER2阳性SKBR-3肿瘤细胞及HER2阴性Hela肿瘤细胞中表达.方法: 用 PCR法获得截短型转位肽重组抗体/颗粒酶B基因片段, 并克隆构建真核表达载体,以脂质体法转染SKBR-3细胞及Hela细胞, 用免疫细胞化学染色检测其在不同细胞中的表达及对细胞形态的影响.结果: 成功构建了编码截短型转位肽重组抗体/颗粒酶B基因的真核表达载体pCMV-e23sFv-FSD-GrB, 用免疫细胞化学检测发现, 绝大多数Hela细胞可高表达e23sFv-FSD-GrB 蛋白, 且细胞形态正常, 而表达e23sFv-FSD-GrB 蛋白的SKBR-3细胞形态发生变化, 出现固缩细胞.结论: 截短型转位肽重组抗体/颗粒酶B基因真核表达体系的建立, 为确定PE转位肽的小转位功能区段奠定了基础.
作者：张莉；赵晶；王智；温伟红；张盈华；王成济；杨安钢 刊期： 2003年第05期
目的:构建钇-十二烷四乙酸(Y-DOTA)免疫噬菌体Fab抗体库.方法:将牛血清白蛋白(BSA)与DOTA交联,并与金属Y鳌合制备成BSA-Y-DOTA,用其免疫BALB/c小鼠.检测抗血清的滴度后,分离抗体阳性的小鼠脾淋巴细胞,提取总RNA.利用RT-PCR扩增全套重链Fd和轻链基因,依次插入经改造的噬菌体载体pComb3M的相应酶切位点,构建成Fab噬菌体抗体库.用酶切、序列测定及ELISA等方法,对重组率、多样性及Fab的展示情况进行鉴定.结果:成功得制备了BSA-Y-DOTA交联物,并获得较好的免疫效果.免疫小鼠的全套重链Fd片段和轻链均得到正确扩增;d片断和轻链基因均插入到载体pComb3M中;ab抗体库的库容量达8×107;重组率约为90%,且具有良好的抗体基因多样性.另外,Fab片段也被展示于噬菌体表面.结论:成功地构建了半抗原Y-DOTA的Fab噬菌体抗体库,为筛选Y-DOTA特异性抗体奠定了基础.
作者：宋斐；邢金良；张思河；杨向民；陈志南 刊期： 2003年第05期
目的:了解BLCAP蛋白表达与骨肉瘤恶性程度的关系.方法:采用SABC法,对临床收集骨肉瘤病理标本进行检测,观察BLCAP蛋白表达情况,结合临床随访结果,判断BLCAP蛋白表达与骨肉瘤恶性程度之间的关系.结果:BLCAP蛋白在原发骨肉瘤组织中表达阳性率约为65.6%,而在复发性骨肉瘤组织中表达阳性率只有25.0%.结论:BLCAP蛋白表达水平与骨肉瘤恶性程度之间有一定的相关性,对临床判断骨肉瘤的预后有一定参考价值.
作者：苏海川；赵玉红；范德刚；范清宇；张鹏；文艳华；刘云燕 刊期： 2003年第05期
目的:构建能抑制MHC-Ⅱ类分子表达的MHC-Ⅱ类分子反式激活因子(MHC class Ⅱ transactivator, CⅡTA)基因的突变体, 并探讨其抑制MHC-Ⅱ类分子表达的机制.方法: 用PCR、酶切及连接技术, 构建不含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA2, 含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA3以及含起始密码子及NLS(nuclear localization signal)的pcDNA3mCⅡTA4突变体.用脂质体转染法, 将上述3种突变体及空载体pcDNA3转入Hela细胞和Raji细胞中.用流式细胞术和RT-PCR法, 观察他们对Hela/Raji细胞HLA-DR/DQ分子的诱导性和组成性表达的影响.将mCⅡTA4转移到对四环素浓度依赖的质粒pUHD10-3上, 通过改变培养环境中四环素的浓度, 调节外源CⅡ TA突变体的表达量, 观察突变体的表达量与MHC-Ⅱ类分子受抑率的关系.结果: 细胞和基因水平证实, pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4对Hela/Raji细胞HLA-DR/DQ的表达均有明显的抑制作用; 而pcDNA3mCⅡTA2和空载体pcDNA3无此作用.MHC-Ⅱ类分子被抑制的程度与外源转入CⅡTA突变体(pUHD10-3mCⅡTA4)的量明显相关.结论: 成功地构建pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4, 并能抑制HLA-Ⅱ类分子的表达.初步证实CⅡTA突变体是通过与胞内的野生型CⅡTA竞争性结合反式激活蛋白, 来抑制MHC-Ⅱ类分子的转录和表达.
作者：欧启水；林琳；黄立东；陆佩华；周光炎 刊期： 2003年第05期
目的:构建编码抗人精浆蛋白抗体Fab基因的表达载体,并在大肠杆菌中进行表达.方法:从克隆载体pUC19-К和pBluescript KS(M13-)-Fd中,酶切获得抗人精浆蛋白单克隆抗体(mAb)Fd基因和К链基因.然后将Fd和К链基因重组到Fab表达载体pComb3中,构建抗人精浆蛋白Fab基因的重组表达载体pComb3-Fab,并在XL1-Blue菌中表达.结果:经重组表达载体转化的XL1-Blue菌株可表达Fab基因.Western blot和免疫细胞化学分析表明,表达产物Fab具有特异性结合精浆蛋白的活性.结论:抗人精浆蛋白Fab基因成功地获得,为进一步将其与抗肿瘤药物偶联用于前列腺癌的导向治疗创造了条件.表达为构建其它基因工程抗体提供了基础.
作者：孙脊峰；杨洁；郝晓柯；赵晶；温伟红；金明；王成济；杨安钢 刊期： 2003年第05期
目的:探讨重症肌无力(MG)胸腺细胞凋亡异常、Fas表达异常在自身免疫应答形成中的作用.方法:用手术切除的MG患者的胸腺,制备胸腺提取液和胸腺细胞悬液,用MTT比色法测定胸腺细胞的增殖;用DNA电泳及细胞形态学观察细胞凋亡;用流式细胞仪检测细胞表面Fas的表达,用RT-PCR结合单链多态构象性分析(SSCP),探讨Fas基因的转录及可能存在的Fas基因突变.结果:MG患者的胸腺提取液,能抑制正常胸腺细胞增殖,但不能抑制MG患者胸腺细胞增殖.在地塞米松作用下,正常人及患者胸腺细胞的增殖均可被抑制,细胞增殖抑制率分别为58.33%和54.26%.MG患者胸腺细胞的DNA电泳可见梯状条带,并且胸腺细胞上Fas的表达百分率增加[(20.38±6.07)%],与空白对照组[(12.43±4.32)%]相比较P<0.05.对MG患者胸腺细胞Fas mRNA进行RT-PCR-SSCP分析,部分MG患者出现异常电泳条带.结论:MG患者胸腺细胞的凋亡及Fas分子表达均异常,而且存在Fas基因突变,提示与本病的发生发展有关.
作者：杜英；张清勇；阮丽荣；梁长春；李倩如；何炜 刊期： 2003年第05期
宫颈癌是常见的女性生殖道恶性肿瘤,高危型人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus 16,HPV16)感染与其密切相关.该病毒的长控制区(long control region,LCR)内有细胞型特异性增强子(cell-type-specific enhancer,CTSE),是LCR的重要组成部分,参与诱导启动子P97的活性,从而调控转化基因E6/E7转录的水平.本研究旨在检测HPV16 CTSE变异株在宿主细胞内的物理状态和CTSE变异的关系,探讨两者在宫颈癌发生、发展中的地位和作用,为深入揭示HPV的致癌机制奠定基础.
作者：刘文康；楚雍烈；杨娥；刘湘；郑建武 刊期： 2003年第05期
目的:制备兔抗小鼠脾酪氨酸激酶(Syk)抗体,分析其在乳腺癌诊断中的价值.方法:应用重组小鼠Syk蛋白,常规免疫雄性家兔制备抗Syk抗体.用免疫印迹法检测Syk抗体的纯度和特异性.应用免疫组化法,检测乳腺组织中Syk蛋白的表达.结果:用重组小鼠Syk蛋白免疫家兔6 wk后,静脉血中抗Syk抗体效价为1∶6 400(A450=1.03).将Syk经SDS-PAGE分离,可见1条相对分子质量(Mr)为72 000的蛋白条带,与理论值相符.用抗Syk血清做免疫印迹证实,在Mr为72 000处有1条明显的带,证明是抗Syk特异性抗体.乳腺组织切片经抗Syk抗体免疫组化染色,在正常乳腺组织细胞胞浆中可见棕黄色颗粒,而浸润性乳腺导管癌组织的细胞浆不着色.结论:制备了高效价、特异性的兔抗Syk抗体.用该抗体检测证实,Syk在正常乳腺组织细胞中呈高表达,在乳腺癌组织细胞中表达缺失. 有可能用于乳腺癌的临床诊断.
作者：单保恩；董青；王晓玲；陈兴；董金琢；马洪 刊期： 2003年第05期
目的:利用噬菌体随机肽库,体内筛选可与胃癌移植瘤血管内皮细胞特异结合的多肽片段,为肿瘤的血管抑制治疗提供有效的方法和手段.方法:采用肾包膜下移植法(SRCA),建立免疫抑制小鼠肾包膜下人胃癌移植瘤模型.在小鼠体内对噬菌体十二肽库进行4轮淘筛,回收移植瘤和对照组织(脑)中的噬菌体并滴定计数.同时,用免疫组织化学染色法,检测噬菌体在移植瘤组织中的分布情况.结果:与胃癌移植瘤血管特异结合的噬菌体得到富集,为对照组织(脑)的3.4倍.随机挑取单个克隆测序鉴定,发现十二肽YESIRIGVAPSQ的出现次数多,免疫组化染色显示,噬菌体注入小鼠尾静脉5 min 后,定位于移植瘤血管的内皮细胞.向小鼠体内单独注入呈现十二肽YESIRIGVAPSQ的噬菌体,从胃癌移植瘤组织回收的噬菌体数量为对照组织(脑)的4.2倍,肺的4.9倍,心脏的5.4倍.结论:筛选到的模拟短肽YESIRIGVAPSQ,有可能成为肿瘤血管靶向治疗的有效工具.体内淘筛噬菌体随机肽库,筛选与靶器官血管内皮细胞特异结合的短肽是可行的,具有推广和应用价值.
作者：王瑜；吴开春；聂勇战；韩者艺；韩全利；乔泰东；樊代明 刊期： 2003年第05期
目的:探讨HSV-1在诱导Hela细胞凋亡中, 细胞内游离钙浓度的变化及钙离子螯合剂对HSV-1诱导Hela细胞凋亡的抑制作用.方法: HSV-1感染Hela细胞后, 用扫描电镜及透射电镜观察凋亡情况.用荧光探针标记细胞内游离Ca2+, 在不同时间观察细胞内游离Ca2+浓度的变化.结果: HSV-1感染Hela细胞后,出现了典型的凋亡形态学变化.细胞内游离Ca2+浓度在HSV-1感染Hela细胞后12 h达高峰; 典型的凋亡形态学变化出现在HSV-1感染Hela细胞后24 h.细胞内Ca2+螯合剂能显著抑制HSV-1诱导的Hela细胞凋亡.结论: 细胞内游离Ca2+在HSV-1诱导的Hela细胞凋亡过程中, 具有重要作用, 此实验结果为临床治疗相关疾病提供了有用的线索.
作者：杨秋霞；姜洪池；李斌；郗雪艳；刘玉；王兰；吕雪莹；谷金宇；李殿俊 刊期： 2003年第05期
碘是人体必需的微量元素之一,是机体合成甲状腺激素T3、T4的主要原料,而且又是重要的甲状腺功能调节因子,在自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease,AITD)的发病机制中起着非常重要的作用,但其具体的发病机制尚未阐明.
作者：余霄龙；闫胜利；王颜刚；綦玉芹；王娈 刊期： 2003年第05期
目的:构建人抗戊型肝炎病毒 (HEV) 噬菌体抗体库,筛选人源中和性抗HEV的单克隆抗体(mAb) .方法:取抗HEV抗体阳性的6例HE患者静脉血,分离淋巴细胞,提取细胞总RNA后逆转录.用一组人IgG Fab基因特异性引物,分别扩增IgG κ0轻链与重链Fd 段基因.将κ轻链与Fd段基因先后克隆入噬菌体载体pComb3的相应位点,经电穿孔法转化大肠杆菌XL1-Blue,再以辅助噬菌体VCSM13超感染,构建人抗HEV噬菌体抗体库.采用独特的5轮筛选法(逐渐降低抗原包被量,严格洗脱条件),以固相化的4种含中和抗原表位的HEV 代表株ORF2重组混合抗原,筛选人噬菌体抗体库,并以 ELISA鉴定噬菌体抗体.结果:经数次电转化构建了容量为1.9×107重组率为80%的κ轻链基因库;容量为1.8×107重组率为20%的Fab基因库.以含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原特异淘筛5次,出现特异富集.ELISA鉴定第5轮筛选产物,得到4株与HEV ORF2重组混合抗原具有较高亲和力的Fab噬菌体抗体,可能为中和抗体.结论:成功地构建了人抗HEV噬菌体抗体库,并获得人源抗HEV特异性噬菌体抗体.
作者：魏华；张建琼；吕海芹；孟继鸿；鲁晓瑄；谢维 刊期： 2003年第05期
目的:探讨腹腔环境在子宫内膜异位症发病机制中的作用,以及腹腔液血管内皮细胞生长因子(VEGF)的来源和调节.方法:将14例子宫内膜异位症患者和10例正常妇女腹腔液中的巨噬细胞体外培养,并在培养的正常妇女腹腔液巨噬细胞中加入17-β雌二醇、孕酮和脂多糖(LPS)共培养.用ELISA法检测培养的巨噬细胞上清液中VEGF的水平.同时将二者无血清培养的上清液,加入到内皮细胞中培养,用MTT比色法检测其对内皮细胞增殖活性的影响.用免疫组化法检测两者的巨噬细胞表达受体flt-1和flt-4 的水平. 结果:子宫内膜异位症患者的巨噬细胞培养上清液中,VEGF的浓度明显高于正常对照组(P<0.05),且无周期性变化(P>0.05).子宫内膜异位症患者的巨噬细胞无血清培养上清液,在体外能显著提高内皮细胞的增殖活性(P<0.05).雌激素和孕激素能显著增加体外巨噬细胞分泌VEGF的水平(P<0.05),与LPS组相比较差异显著(P<0.05),即激素的调节作用大于LPS的作用.但雌激素和孕激素调节巨噬细胞分泌VEGF的程度无明显差别(P>0.05).LPS激活的巨噬细胞能增加雌激素、孕激素对巨噬细胞分泌VEGF的调节作用(P<0.05).巨噬细胞能表达受体flt-1和flt-4,无周期性变化(P>0.05).结论:子宫内膜异位症患者的腹腔液中的巨噬细胞可分泌VEGF,改变腹腔液的环境,可促使内皮细胞增殖,促进子宫内膜异位症的血管形成.
作者：吴献青；方小玲；林秋华；黄凤英；夏晓梦 刊期： 2003年第05期
目的:探讨核因子-κB(NF-κB)p65在口服耐受发生中的活性改变及其意义.方法: 雌性Wistar大鼠30只随机分成两组: ①口服耐受组, 用小剂量(每次8 mg/2 mL PBS)的Fx1A抗原灌胃.②对照组, 用PBS 2 mL/次灌胃.观察大鼠迟发型超敏反应(DTH), 进行脾淋巴细胞增殖试验, 了解大鼠免疫功能的改变.以免疫组化和ELISA法, 检测大鼠淋巴组织中NF-κB p65的活性及TGF-β1的表达.结果: 与对照组相比较, 口服耐受组大鼠DTH和抗原特异性淋巴细胞增殖反应明显受抑制; 肠黏膜Peyer's淋巴结(PP结)中NF-κB p65的活性及TGF-β1的表达明显增加.脾淋巴组织中NF-κB p65的活性降低, 但TGF-β1的表达明显增加.结论: 低剂量Fx1A抗原诱导的口服耐受的发生, 可能与不同部位免疫细胞内NF-κB p65的活性改变有关.
作者：杜晓刚；甘华；陈雪梅 刊期： 2003年第05期
目的:应用本室制备的抗单链DNA(ssDNA)单克隆抗体(mAb),检测多种化疗药物对不同肿瘤细胞株凋亡的诱导作用,并根据凋亡率判断肿瘤细胞对化疗药物的敏感性. 方法:用血浆峰值浓度(PPC)的9种化疗药物,分别诱导肿瘤细胞株K562和Hep-2的凋亡.用抗ssDNA mAb免疫组化染色法,检测肿瘤细胞株的凋亡并计算调亡率.结果:以抗ssDNA mAb建立的检测细胞凋亡的免疫组化法,能够区分凋亡细胞和非凋亡细胞.该法检测证明,化疗药物可诱导敏感肿瘤细胞株凋亡,但不同化疗药物诱导同一肿瘤细胞株或不同肿瘤细胞株凋亡的程度不同.结论:抗ssDNA mAb免疫组化法,可用于检测肿瘤细胞对化疗药物的敏感性.
作者：吴晓燕；徐志伟；吴国庆；苗乃法；冯永堂 刊期： 2003年第05期
有关多发性肌炎(PM)/皮肌炎(DM)外周血淋巴细胞亚群的研究仅见早期报道,且尚无统一结论.为探讨PM/DM外周血单个核细胞(PBMC)HLA-DR的表达及其意义,我们应用双荧光抗体标记、流式细胞仪(FACS)进行了检测.
作者：张士发；梁再赋；许静；赵丽萍；王良明；顾绍裘 刊期： 2003年第05期
目的:探讨乙酰肝素酶mRNA(acetyl-heparanase mRNA)、层黏连蛋白(laminin,LN)及其受体(laminin recepter,LR),在50例卵巢癌、33例淋巴结转移卵巢癌及10例浆液性囊腺瘤中的表达,及其在卵巢癌转移中的作用.方法:应用原位杂交和免疫组化染色方法,检测乙酰肝素酶mRNA转录水平及LN和LR的蛋白的表达及定位.结果:乙酰肝素酶mRNA在卵巢癌病灶及转移淋巴结中的转录水平明显增强,原发灶与转移灶之间的表达差异显著(P<0.05),恶性肿瘤与良性肿瘤之间表达的差异更为明显(P<0.01).LN在癌组织及转移淋巴结中的表达少;而LR的表达却明显增强.乙酰肝素酶mRNA与LN表达呈负相关,与LR的表达呈正相关.结论:乙酰肝素酶mRNA的表达与LN和LR的表达之间分别呈正、负相关性,提示乙酰肝素酶是参与肿瘤的生长、侵袭和转移的方式之一.
作者：刘玉；辛晓燕；韩良辅；王德堂 刊期： 2003年第05期
目的:研究荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测HBV-DNA对辨别病毒复制的临床意义.方法:采用FQ-PCR和ELISA方法,检测79例患者血清HBV-DNA拷贝数和免疫学血清指标.结果:26例HBsAg、HBeAg、抗-HBc均阳性的标本,HBV-DNA也全部阳性,平均拷贝数为2.7×105/mL.8例HBsAg、HBeAg阳性的标本,HBV-DNA也全部阳性,平均拷贝数为5.2×104/mL.21例HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均阳性的标本HBV-DNA阳性率为66.7%,平均拷贝数为3.1×104/mL.9例HBsAg阳性的标本HBV-DNA阳性率为11%.平均拷贝数为1.4×103/mL.结论:荧光定量聚合酶链反应检测HBV-DNA可以更加准确地判断HBV的感染和复制情况.
作者：许丽艳；敬华；杨晋德；刘春雷 刊期： 2003年第05期
目的:构建乙型肝炎病毒(HBV)变异s基因真核表达载体,检测其诱导小鼠产生特异性体液免疫应答.方法:利用限制性内切酶定位克隆构建s基因nt587 G→A的真核表达载体pCMV-S2.S+145R(PR).用其转染人肝癌细胞系Hep G2后,用EIA、ELISA及免疫细胞化学法,观察其抗原性.以重组变异型s基因真核表达载体(PR)和载体pcDNA3.0分别免疫C57BL/6小鼠各5只.每只小鼠各肌肉注射纯化质粒100 μg.用ELISA法检测血清抗-HBs及抗-HBs2抗体的效价.结果:体外实验证实,变异型HBsAg可与抗-HBs结合;PR免疫小鼠可诱导其产生抗-HBs抗体及抗-HBs2抗体,但抗-HBs2抗体的出现早于抗-HBs抗体约1～2 wk.结论:HBV变异s基因(nt587 G→A)的真核表达载体的表达产物具有良好的抗原性,能够诱导C57BL/6小鼠产生体液免疫应答.
作者：葛军辉；刘惠敏；何金；李玉莉；余宏宇；叶忠；张乐之；胡以平 刊期： 2003年第05期
目的:构建人LIGHT-Fc基因的真核表达质粒,并表达获得有较高生物学活性的纯化人LIGHT-Fc融合蛋白.方法:从cDNA文库中PCR扩增LIGHT全长编码基因,并导入克隆载体.测序证实后,继续用PCR扩增其膜外区cDNA,用重叠延伸技术(SOE)引入CD137信号肽基因.将SOE产物与hIgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中,瞬时转染293T细胞,用夹心ELISA检测其表达情况,经蛋白A亲和纯化,用SDS-PAGE检测其纯度与Mr,并以肿瘤细胞为靶细胞,检测其生物学活性.结果:测序证实构建的LIGHT与LIGHT-Fc cDNA阅读框完整,连接部位序列正确;ELISA和SDS-PAGE证实LIGHT-Fc融合蛋白的表达与纯度;MTT证明人LIGHT-Fc蛋白对一些肿瘤细胞系具有生长抑制作用.结论:获得了有抗肿瘤活性的纯化hLIGHT-Fc融合蛋白,为探讨LIGHT在免疫自稳调节中的地位、结合相应受体后的动力学与信号转导机制,以及探索LIGHT的其他生物学功能奠定了坚实的实验基础.
作者：黄钢；白云；姜曼；黎万玲 刊期： 2003年第05期
细胞与分子免疫学杂志
主管:中国免疫学会；第四军医大学
主办：陕西省免疫学会,中国免疫学会
